请各位大侠帮忙分析一下我该怎么办?做TA克隆,将P - 已解决

请各位大侠帮忙分析一下我该怎么办?做TA克隆,将PCR产物通过切胶回收,跑电泳显示目的基因回收成功,然后按1ulT载体,

请各位大侠帮忙分析一下我该怎么办?做TA克隆,将PCR产物通过切胶回收,跑电泳显示目的基因回收成功,然后按1ulT载体,4ul目的基因,5ul solutionI连T载4小时,做转化,快检显示全部是空载然后又做一次,按0.5ul T载体,4.5 ul目的基因,5ul solutionI连T载16小时,做转化,快检显示也全部是空载 .后来又按这个步骤做,还是空载,这到底是怎么回事?到底错在哪?实验材料应该没问题,实验室的人也在做,做成功了,可是我做的全部是空载,照胶结果显示条带比我的目的基因略大200到300bb,这又是怎么回事?

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TA 克隆不需要切胶提纯的.你PCR做完后,用一点跑个胶证实一下产物的特异性.不要有多个条带和拖尾.不要用高保真taq酶.提胶的缓冲液可能含有对下一步反应的抑制物.你的条带比预期的产物大,很可能就是非特异产物.PCR的产物可以直接和TA载体混合,用Invitrogen的试剂盒的话,直接放置室温半小时就可以做转化了,其他的试剂盒按照生产厂家的步骤.不需要连接酶的,转入细菌后,细菌内的连接酶会连接断口.你说的空载是啥?做TA后,不能直接做PCR验证,必须转染细菌后,细菌内的连接酶连接端口,扩增,再提质粒才可以做验证.如果没有细菌克隆的话,你的细菌是否被多次冻融,失活了?还是抗生素没用对?

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