我也是用cDNA做模板的,没有出现过弥散带的情况,但经常出现非特异性条带.出现弥散带的原因可能是你在做凝胶电泳时电泳液被污染或者是做的胶有问题,也可能是你的cDNA部分降解了,至于降解的原因主要是由于时间和温度.扩增完的东西要立即进行电泳,其次电泳的室温不宜太高时间不要太长,一般最多半个小时左右.另外在扩增过程中,由于气候的缘故,部分PCR仪在室温超过30度后就不能正常工作了,这要看PCR仪的型号,其次是前期的RNA提取的效果不好,或者是提取的RNA已经出现降解导致cDNA模板质量受到影响.
最后要说一下关于PCR部分,PCR的体系和退火温度很重要,特别是镁离子的浓度,最好是用正交试验摸索出最好的体系,然后用温度梯度找到最适合的退火温度.因为设计的好不好也是重大问题之一啊,你先试试看吧!
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