【 原 理 】
转氨酶是体内重要的一类酶.转氨酶催化α–氨基酸的α–氨基与α–酮酸的α–酮基之间的相互转化,从而生成一种新的氨基酸与一种新的酮酸,这种作用称为转氨基作用.它在生物体内蛋白质的合成,分解等中间代谢过程中,在糖,脂及蛋白质三大物质代谢的相互联系,相互制约及相互转变上都起着很重要的作用.
在动物机体中活力最强,分布最广的转氨酶有两种:一种为谷氨酸草酰乙酸转氨酶(glutamic-Oxaloacetate transaminase简称GOT),另一种为谷氨酸丙酮酸转氨酶(glutamic-pyruvic transaminase简称GPT).本实验以谷氨酸丙酮酸转氨酶为例.它的催化反应如下:
GPT
丙氨酸 + α–酮戊二酸 谷氨酸 + 丙酮酸
37℃
由上可见此反应最终产物是丙酮酸.测定单位时间内丙酮酸的产量即可得知转氨酶的活性.
丙酮酸可与2,4–二硝基苯肼反应,形成丙酮酸二硝基苯腙,在碱性溶液中呈棕红色,显色的深浅在一定范围内可反映所生成的丙酮酸量多少,与同样处理的丙酮酸标准液进行比色,计算出其含量,以此测定转氨酶的活性.
丙酮酸 + 2,4–二硝基苯肼 丙酮酸–2,4–二硝基苯腙(棕红色)
本实验用金氏(King)法(1)测定转氨酶的活性单位为:每毫升血清与基质在37℃下作用60分钟,生成1μmol丙酮酸为1个单位.
【 试剂和器材 】
一 试剂
1.1/15 mol/L pH7.4磷酸盐缓冲溶液:
甲液:1/15 mol/L磷酸氢二钠溶液:称取磷酸氢二钠(Na2HPO4)9.47g(或Na2HPO4 · 12H2O 23.87g)溶解于蒸馏水中,定容至1 000 ml.
乙液:1/15 mol/L磷酸二氢钾溶液:称取磷酸二氢钾(KH2PO4)9.078g,溶解于蒸馏水中,定容至1 000 ml.
取甲液825 ml乙液175 ml混合,测其pH为7.4即1/15 mol/L pH7.4磷酸盐缓冲液.
2.GPT基质液:精确称取a–酮戊二酸29.2 mg及DL–丙氨酸1.78g,溶于1/15 mol/L pH 7.4的磷酸盐缓冲液50ml 中溶解,加1mol/L NaOH溶液0.5ml,校正pH至7.4.再以pH 7.4的磷酸缓冲液定容至100ml,充分混合,冰冻贮存.
3.2,4–二硝基苯肼溶液:精确称取2,4–二硝基苯肼20mg,先溶解于10ml浓盐酸中(可加热助溶),再以蒸馏水稀释至100ml(有沉渣可过滤),棕色瓶内保存.(注意:此溶液配制时释放大量的热和难闻气味配制时应戴上口罩)
4.丙酮酸标准液(1ml = 2μmol丙酮酸即2mmol/L):精确称取丙酮酸钠22mg于100ml容量瓶中,用1/15 mol/L pH 7.4磷酸盐缓冲溶液稀释至刻度.此溶液应新鲜配制,不能存放.
5.0.4 mol/L氢氧化钠溶液:称取16g氢氧化钠溶解于蒸馏水中,定容至1 000ml.
6.1mol/L氢氧化钠溶液:称取4g氢氧化钠溶解于蒸馏水中,定容至1 00ml.
7.血清300ml.
二 器材
1.水浴锅.
2.分光光度计.
【 操 作 】
1.标准曲线制作:取6支试管按下表操作.
试管号
试 剂
1 2 3 4 5 6
丙酮酸标准液 (ml)
GPT基质液 (ml)
PH7.4磷酸缓冲液(ml)
0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25
0.5 0.45 0.4 0.35 0.3 0.25
0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1
水浴37℃,10分钟
2,4二硝基苯肼溶液(ml) 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
保温37℃,20分钟
0.4N氢氧化钠溶液 (ml) 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0
相当活性(单位数) 空白 100 200 300 400 500
混匀后,用分光光度计在520nm波长处进行比色测定,以空白调零,读取各管吸光度读数.以各管相应的转氨酶活性单位值为横坐标,吸光度值为纵坐标,用坐标纸绘制标准曲线.
2.GPT测定:取2支洁净的试管按下表操作.
试 剂 空 白 测 定
血 清 (ml) 0.1 0.1
G PT基质液 (ml) -- 0.5
混匀, 37℃水浴,60分钟
G PT基质液 (ml) 0.5 --
2,4二硝基苯肼溶液 (ml) 0.5 0.5
混匀, 37℃水浴,20分钟
0.4mol/L氢氧化钠 (ml) 5.0 5.0
混匀,放置5分钟,用分光光度计在波长520nm波长处进行比色测定,以空白调零,读取测定管吸光度值.
【 实验结果 】
所测得的吸光度值在已绘制好的标准曲线上直接查对,即可得知待测转氨酶的活性单位.
【 注意事项 】
1.测定血清中转氨酶活性主要有金氏 (King) 法,赖氏 (Reitman—Frankel)法和改良穆氏(Mohun)法.这三种方法的原理,试剂和操作方法包括血清和试剂的用量及作用温度均相同,不同之处是金氏法酶作用时间为60分钟,而其他二法为30分钟.因此活性单位定义不同.
2.转氨酶只作用于L–型氨基酸,对D–型氨基酸无催化能力.实验中所用的是DL–型的混旋氨基酸.若采用L–型时,则用量比DL–型少一半.
3.所用仪器应清洁,不应含有酸,碱,Zn2+,Ca2+,Hg2+,Ag+等蛋白沉淀剂.
4.血清不应溶血,因血细胞内转氨酶含量较多.样品采集后应当日进行测定,否则应将血清分离后贮存于冰箱.
5.温度及时间一定要严格控制,准确掌握.pH要准确以免影响酶活性.
实验二 过氧化氢酶及过氧化物酶的作用
【 原 理 】
在生物机体内,某些代谢物由于需氧脱氢的结果而产生对机体有害的过氧化氢.体内的过氧化氢酶能催化过氧化氢分解成水和分子氧,使过氧化氢不致在体内积累.因此,过氧化氢酶具有保护生物机体的作用.
过氧化氢酶是一种以铁卟啉为辅基的酶,它广泛存在于动植物组织中.
过氧化物酶也是一种以铁卟啉为辅基的酶,它能催化过氧化氢释放出新生态氧以氧化某些酚类和胺类物质,例如,氧化溶于水中的焦性没食子酸生成不溶于水的焦性没食子橙(橙红色).其作用机制如下:
E + H2O2 E–H2O2
E–H2O2 + H2O2 E + 2 H2O + O2
【 试剂和器材 】
一 试剂
2%过氧化氢溶液:此溶液易见光分解,应新鲜配制.
1%焦性没食子酸溶液:焦性没食子酸1g,用蒸馏水溶解并配至100ml.此溶液易
氧化,应新鲜配制.
铁粉.
二 材料
鲜猪肝糜.
马铃薯或血液.
白菜梗提取液:白菜梗约5g,切成细块,置研钵内,加蒸馏水15ml研磨成浆,转
移出滤液,备用.
【 操 作 】
1.过氧化氢酶的作用
取试管5支,按下表操作:
试管 2% H2O2(ml) 新鲜肝糜 (g) 煮沸肝糜(g) 生马铃薯(g) 熟马铃薯(g) 铁粉
1 3 0.5 - - - -
2 3 - 0.5 - - -
3 3 - - 1 - -
4 3 - - - 1 -
5 3 - - - - 少许
加毕,观察有无气泡放出,特别是肝糜周围和马铃薯周围.
2.过氧化物酶的作用
取试管4支,按下表操作:
试管 1%焦性没食子酸 2% H2O2 蒸馏水 白菜梗提取液 煮沸的白菜梗提取液
(ml) (滴) (ml) (ml) (ml)
1 2 2 2 - -
2 2 - - 2 -
3 2 2 - 2 -
4 2 2 - - 2
摇匀后,观察并记录各管颜色变化和沉淀的出现.
实验三 琥珀酸脱氢酶及丙二酸的抑制作用
【 原 理 】
琥珀酸脱氢酶是三羧酸循环中的一个重要的酶,测定细胞中有无这种酶可以初步鉴定
三羧酸循环途径是否存在.琥珀酸脱氢酶可使其底物脱氢,产生的氢可通过一系列传递体最后递给氧而生成水.在缺氧的情况下,若有适当的受氢体也可显示出脱氢酶的作用.如心肌中的琥珀酸脱氢酶在缺氧的情况下,可使琥珀酸脱氢生成延胡索酸,脱下之氢可将蓝色的甲烯蓝还原成无色的甲烯白.这样,便可以显示琥珀酸脱氢酶的作用.
琥珀酸 + 甲烯蓝 琥珀酸脱氢酶 延胡索酸 + 甲烯白
丙二酸的化学结构与琥珀酸相似,它能与琥珀酸竞争而和琥珀酸脱氢酶结合.若琥珀酸脱氢酶已与丙二酸结合,则不能再催化琥珀酸脱氢,这种现象称为竞争性抑制.如相对地增加琥珀酸的浓度,则可减轻丙二酸的抑制作用.
【 试剂和器材 】
一 试剂
1.1.5%琥珀酸钠溶液:取琥珀酸钠1.5g,用蒸馏水溶解并稀释至100ml.如无琥珀酸钠可用琥珀酸配成水溶液后,以氢氧化钠溶液中和至pH7~8.
2.1%丙二酸钠溶液:取丙二酸钠1g,用蒸馏水溶解并稀释至100ml.
3.0.02%甲烯蓝溶液.
4.1/15mol/LNa2HPO4溶液:取Na2HPO4 · 2H2O 11.88g,用蒸馏水溶解并稀释至1 000ml.
5.液体石蜡.
二 器材
1.玻璃匀浆器.
2.离心机.
三 材料
新鲜猪心.
【 操 作 】
1.猪心脏制备液:称取新鲜猪心1.5~2.0g玻璃匀浆器放中,加入等体积的石英砂及1/15mol/LNa2HPO4溶液3~4ml,捣碎成浆,再加入6~7ml1/15mol/LNa2HPO4溶液,放置一小时,不时摇动,离心(3000r/min 10 min)取上清液备用.
2.取4支试管,编号并按下表操作:
试管 心脏制备液 1.5%琥珀酸钠溶液 1%丙二酸钠溶液 蒸馏水 0.02%甲烯蓝溶液
(滴) (滴) (滴) (滴) (滴)
1 5 5 - 10 2
2 5(先煮沸) 5 - 10 2
3 5 5 5 5 2
4 5 10 5 5 2
3.各管溶液混匀后,每管各加液体石蜡一薄层(约5~10滴).为什么
4.各管置于37℃水浴中,半小时内观察各管颜色变化,比较其速度并说明原因.然后将第一管用力摇动,观察其有何变化 为什么
实验四 γ–球蛋白的分离
【 原 理 】
中性盐 (如硫酸铵,硫酸钠,氯化钠,硫酸镁等)对球状蛋白质的溶解度有显著影响.随着中性盐浓度的增加,离子强度也增加.当溶液离子强度增加到一定数值时,溶液中蛋白质的溶解度开始下降.离子强度增加到足够高时,蛋白质可从水溶液中沉淀出来,这种现象叫做盐析.各种蛋白质的溶解度不同,因而可利用不同浓度的高浓度盐溶液来沉淀分离各种蛋白质.
蛋白质是一种生物大分子,它具有不能通过半透膜的性质.透析就是利用这种性质使之与其它小分子物质如无机盐,单糖等分开.本次实验应用的是脱盐透析,即盐析后,将含大量盐类的蛋白质溶液放在半透膜的袋内,再将透析袋浸入蒸馏水中.经过一段时间,袋内的盐类浓度即逐渐降低.若经常更换袋外的液体,最后即可使袋内的蛋白质溶液中所含的盐类除净,从而达到脱盐的目的.应用不同浓度硫酸铵分段盐析法将血清中γ–球蛋白及α,β球蛋白分离,最后用透析法脱盐,即可得到纯度较高的γ–球蛋白.
【 试剂和器材 】
一 试剂
1.pH 7.2,0.01mol/L磷酸盐缓冲液生理盐水(简称PBS): 取0.2mol/L Na2HPO4溶液36.0ml,0.2mol /L NaH2PO4溶液14.0ml混合,加NaCl 8.5克,用蒸馏水稀释至1 000ml.
2.pH7.2饱和硫酸铵溶液:用浓氨水将2 000ml饱和硫酸铵溶液调pH到7.2.
3.纳氏试剂:
纳氏试剂贮存液:于500ml三角烧瓶内加入碘化钾150克,碘110克,汞50克及蒸馏水l00ml,用力振荡7~15分钟,至碘色将转变时,此混合液即产生高热.随即将此烧瓶浸于冷水内振荡,直至棕色之碘转变成带绿色之碘化钾汞溶液为止.将上清液倾入2 000ml量筒内,并用蒸馏水洗涤瓶内沉淀物数次.将洗涤液一并倾入量筒内,加蒸馏水至2 000ml刻度后,混匀即成.
纳氏试剂应用液:取10%氢氧化钠700ml,钠氏试剂贮存液150ml及蒸馏水150ml混匀即成,如显混浊,可静置数日后取上清液使用.此试剂之酸碱度极为重要.用lmol/L盐酸溶液20ml滴定时,需此试剂11～11.5ml恰好使酚酞指示剂变成红色时最为适宜.否则必须纠正其酸碱度.
4.双缩脲试剂:溶解1.50克硫酸铜(CuSO4·5H2O)和6.0克酒石酸钾钠(NaKC4H406 · 4H20)于500ml蒸馏水中.在搅拌下加入10%氢氧化钠溶液300ml,用蒸馏水稀释到1升,贮存在内壁涂以石蜡的瓶中,可长期保存.
5.浓蔗糖液:蔗糖的饱和溶液.
6.10%氢氧化钠:取10克氢氧化钠溶解于蒸馏水中,定容至100ml.
二 器材
1.透析袋.
2.磁力搅拌器.
3.离心机.
三 材料
兔血清
【 操 作 】
一 盐析
1.取离心管1支加入血清2ml,再加入等量PBS稀释血清,摇匀后,逐渐加入pH7.2饱和硫酸铵溶液2ml(相当于33%饱和度硫酸铵),边加边摇.然后静止半小时,再离心(3 000r/min)20分钟,倾去上清液(主要含白蛋白).
2.用lml PBS将离心管底部的沉淀搅拌溶解,再逐滴加饱和硫酸铵溶液0.5m1.摇匀后放置半小时,离心(3 000r/min)20分钟,倾去上清液(主要含α,β球蛋白),其沉淀即为初步纯化的γ–球蛋白.如要得到更纯的γ–球蛋白,可重复盐析过程1～2 次.
3.把提取的γ–球蛋白用1 mlPBS悬浮.
二 透析脱盐与浓缩
1.将盐析得到的γ–球蛋白放入透析袋内,用线绳缚紧上口,用玻璃棒悬在盛有半杯蒸馏水的100ml烧杯中,使透析袋下半部浸入水中.
2.将烧杯放在磁力搅拌器上搅拌1小时以上(中间换水1～2次),然后将透析袋取下.小心将线绳解开,吸取袋内的液体,与烧怀中的水同时用双缩脲试剂检查袋内外的蛋白质,用纳氏试剂检查袋内外液体中的铵离子(NH4+),观察透析法的脱盐效果.
3.脱盐后得到的γ–球蛋白溶液可继续浓缩,即用透析袋装好悬于盛有10ml浓蔗糖或聚乙二醇溶液的小烧杯内1小时以上,观察袋内液体体积的变化.
实验五 γ–球蛋白含量测定(光度分析法)
【 原 理 】
双缩脲法是蛋白质光度分析法的一种,是利用蛋白质的双缩脲反应而测定蛋白质含量的方法.因蛋白质含有两个以上的肽键,所以有双缩脲反应.在碱性溶液中蛋白质与Cu2+形成紫红色络合物,其颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比,而与蛋白质的分子量及氨基酸成分无关.在一定的实验条件下,未知样品溶液与标准蛋白质溶液同时反应,并于540~560nm测定,即可以通过标准蛋白质的标准曲线求出未知样品的蛋白质浓度.
【 试剂和器材 】
一 试剂
1.标准酪蛋白溶液(5mg/ml):用0.05mol/L NaOH溶液配制:5g酪蛋白加0.05mol/L NaOH溶液至1 000ml.
2.双缩脲试剂:溶解1.5g硫酸铜(CuSO4 · 5H2O)和6.0 g酒石酸钾钠(NaKC4H4O6 · 4H2O)于500ml蒸馏水中.在搅拌下加入10% NaOH溶液300ml,用蒸馏水稀释到1升,贮存在内壁涂有石蜡的瓶中,可长期保存.
3.未知蛋白质溶液:γ–球蛋白溶液.
二 器材
分光光度计.
【 操 作 】
1.标准曲线的绘制:取6支试管按下表操作.
试 剂 1 2 3 4 5 6
标准酪蛋白溶液(ml) 0 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0
蒸馏水 (ml) 2 1.6 1.2 0.8 0.4 0
双缩脲试剂 (ml) 4 4 4 4 4 4
室温下(15~25℃)放置30分钟,用分光光度计于540nm测定.以光密度为纵坐标,酪蛋白含量为横坐标用坐标纸绘制标准曲线.
2.γ–球蛋白溶液浓度的测定:取3支试管按下表操作.
试 剂 空白管 测定1 测定2
γ–球蛋白溶液(ml) - 1 1
蒸馏水 (ml) 2 1 1
双缩脲试剂 (ml) 4 4 4
摇匀,放置30分钟,540nm测定读取光密度.
【 实验结果 】
求出待测蛋白质溶液的光密度后,从标准曲线上查出其蛋白质浓度,按稀释倍数求出每毫升蛋白质溶液的蛋白质含量.
实验六 凝胶柱层析法(γ–球蛋白纯化)
【 原 理 】
凝胶层析(gel chromatography),又称为凝胶过滤(gel filtration),分子筛过滤(molecular sieve filtration),凝胶渗透层析(gel osmotic chromatography)等.它是20世纪60年代发展起来的一种层析技术.其基本原理是利用被分离物质分子大小不同及固定相(凝胶)具有分子筛的特点,将被分离物质各成分按分子大小分开,达到分离的方法.
凝胶是由胶体粒子构成的立体网状结构.网眼里吸满水后凝胶膨胀呈柔软而富于弹性的半固体状态.人工合成的凝胶网眼较均匀地分布在凝胶颗粒上有如筛眼,小于筛眼的物质分子均可通过,大于筛眼的物质分子则不能,故称为"分子筛".凝胶之所以能将不同分子的物质分开是因为当被分离物质的各成分通过凝胶时,小于筛眼的分子将完全渗入凝胶网眼,并随着流动相的移动沿凝胶网眼孔道移动,从一个颗粒的网眼流出,又进入另一颗粒的网眼,如此连续下去,直到流过整个凝胶柱为止,因而流程长,阻力大,流速慢;大于筛眼的分子则完全被筛眼排阻而不能进入凝胶网眼,只能随流动相沿凝胶颗粒的间隙流动,其流程短,阻力小,流速快,比小分子先流出层析柱;小分子最后流出.分子大小介于完全排阻不能进入或完全渗入凝胶筛眼之间的物质分子,则居中流出.这样被分离物质即被按分子的大小分开.
用于凝胶层析的凝胶均为人工合成的产品,主要有交联葡聚糖(商品名为Sephadex),琼脂糖(商品名为Sepharose),聚丙烯酰胺凝胶(商品名为Bio–gel)及具有一定网眼的细玻璃珠等和这些
